ELISA方法现【xiàn】在已经被广泛的应用于各种抗原和抗【kàng】体测定。抛开试剂盒本身质量外，我们在实验中也【yě】有很多因素都【dōu】会【huì】影响试验的【de】正常结果。其中最常出现的问题是显色淡【dàn】，灵敏度偏低【dī】、重复【fù】性不佳、假【jiǎ】阳性【xìng】结【jié】果【guǒ】和假阴【yīn】性【xìng】结【jié】果，不管【guǎn】出现什么【me】样【yàng】的结果都会直接影响我们的实验结【jié】果【guǒ】。下面来分析ELISA实验非【fēi】正常检【jiǎn】测结【jié】果产【chǎn】生的常【cháng】见原因，并分析其【qí】解决办法，以提【tí】高检测质量。

1、方法学的影响

ELISA 测定模式包括以下【xià】几【jǐ】种: 双抗体夹心法、间【jiān】接法【fǎ】、双抗原夹【jiá】心法、IgM 抗体捕捉法、竞【jìng】争抑制【zhì】法【fǎ】, 其中竞争【zhēng】抑制法因受【shòu】操作【zuò】时差所引【yǐn】起的竞争等因【yīn】素的影响, 结果【guǒ】重复性较差, 质量较难【nán】控制。

2、试剂因素

试剂的选择【zé】　检测的【de】原【yuán】理均【jun1】基于抗【kàng】原抗体【tǐ】反应。由于【yú】该反【fǎn】应过程受【shòu】多种因素的影响, 如普遍【biàn】存在基质效应、交叉反应【yīng】等, 因而检测结【jié】果【guǒ】难【nán】以溯【sù】源, 不同方法、不同试剂之【zhī】间甚至同【tóng】一试剂【jì】不【bú】同批号【hào】间结【jié】果均缺乏可比性。试剂质量在很大程【chéng】度上决定了检测的水【shuǐ】平, 因【yīn】此在【zài】引入新项目【mù】之前【qián】必须对【duì】试剂进行【háng】严格的评估。试剂【jì】的评估有【yǒu】以下几个步骤: (1) 确定开展该项目的必【bì】要性; (2) 了【le】解该项目现有的检测方【fāng】法和原理; (3) 在了解试剂的组【zǔ】成基础【chǔ】上选择多家试剂【jì】盒进行比较【jiào】,判断标准参考方法或【huò】参考【kǎo】物质, 其次为临【lín】床的满意度及机构的报告如各级室【shì】间质【zhì】量【liàng】评【píng】价、CDC 报告等; (4) 定期对检【jiǎn】测结果进行追踪反馈直【zhí】至最终认可该【gāi】试剂。

3、样本因素

标本干扰因【yīn】素包括内源【yuán】性干扰因素和外源性干扰因素【sù】,前者【zhě】包括类风湿因子【zǐ】、补体【tǐ】、异【yì】嗜性【xìng】抗体、自身抗体【tǐ】等【děng】, 后者包括标本溶血、标本被污【wū】染、标本贮存时间过长【zhǎng】、标本凝固不全、冷冻标本的反复【fù】冻融等【děng】。其【qí】中外【wài】源【yuán】性干扰因【yīn】素【sù】是我【wǒ】们【men】在检测过程中【zhōng】可以避免也是【shì】必须避免【miǎn】的因【yīn】素, 而避免内源性因素的干扰则主要通过【guò】选择合适的【de】试剂盒【hé】。在临床中遇到少【shǎo】见的疑【yí】难病例时应当考【kǎo】虑到内源【yuán】性干扰因素的存在。以下对外源性干【gàn】扰因素进行简要说明:

标本溶血　要注意避免出【chū】现严【yán】重【chóng】溶血。血【xuè】红蛋白【bái】中含有血红素基团, 其具【jù】有类过【guò】氧化物【wù】的活性【xìng】, 因【yīn】此, 在【zài】以辣根过【guò】氧【yǎng】化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 为标【biāo】记酶的【de】ELISA 测定中, 如果血清标【biāo】本中血【xuè】红蛋白浓度较高, 则其就很容【róng】易在温【wēn】育过程中吸附于固相, 从而与后面加【jiā】入的底物【wù】反应显色。

ELISA 操作【zuò】步骤复杂【zá】, 操作不当将【jiāng】引起较【jiào】大的误差【chà】。以【yǐ】下叙述各个步骤中的影【yǐng】响【xiǎng】因【yīn】素。加样器是一种比较精密【mì】的工具, 其在长时间使用时会因机【jī】械磨损或者推【tuī】动杆内附着血痂等【děng】原因【yīn】造成加样【yàng】不准, 尤其是【shì】对于样本【běn】量较大【dà】的临床实验室【shì】, 因此必【bì】须定期对加液【yè】器进行维护和校准。每次加不同的标本时均需【xū】更换吸嘴【zuǐ】, 以免发生交叉【chā】污染。加样时速度不【bú】可太快, 避免【miǎn】将标本加在孔壁上部【bù】, 并注【zhù】意不要溅出或产【chǎn】生气【qì】泡。加样【yàng】时还应【yīng】当注意操作时差对结【jié】果的影响【xiǎng】, 操作时差是指加入标本、试【shì】剂及【jí】混【hún】匀时间的差异。操作时差在每个实【shí】验中都存在, 尤其是手工操作, 日常检测标本【běn】多达几百个【gè】,从加入【rù】第一【yī】个标本【běn】到最后一【yī】个标本, 需几十【shí】分钟, 加入试剂及混匀等均存在【zài】着【zhe】前后时间【jiān】差异, 使【shǐ】抗原抗体反应和酶【méi】促【cù】反应时间【jiān】不一致, 操作时差【chà】对【duì】竞争法检【jiǎn】测的结【jié】果影响更大【dà】, 在加酶结合物和底物时可用定【dìng】量多道。