在【zài】运用【yòng】ELISA方法【fǎ】测【cè】定抗体方面，通常所用的方法称为间接法【fǎ】，也是【shì】目前常用的方法【fǎ】，其原理：间接法首先用抗原包被于固相载体，这些包被【bèi】的抗原必须是【shì】可溶性的【de】，或者【zhě】至少是【shì】极微小的颗粒，经洗涤，加入含有【yǒu】被测抗体之标本，再经孵育【yù】洗涤后，加入酶【méi】标记抗抗体【tǐ】，(对人【rén】的标本来说即加酶标抗人【rén】球【qiú】蛋白IgG、IgM)，再经孵育洗涤后【hòu】，加底物显色，底物降解的量，即为【wéi】欲【yù】测抗【kàng】体的【de】量，其结果【guǒ】可用目测或用分光【guāng】光【guāng】度【dù】计定量测【cè】定【dìng】。

操作步骤：

1. 将抗【kàng】原按5μg/ml稀释于碳酸【suān】盐缓【huǎn】冲液(pH 9.6)，100μl /孔，4℃过夜【yè】。

2. 次日PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

3. 加2％BSA封闭室温1h，200μl /孔。

4. 阳【yáng】性对照【zhào】从10ug/ml，做倍必稀释，待测血清从1：50做倍【bèi】比稀释【shì】，预【yù】试【shì】验后确定稀【xī】释倍数及阳性对照的起【qǐ】始【shǐ】浓度及稀【xī】释数量(以【yǐ】可以做标准曲线【xiàn】为参数)，室温1h。

5. PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

6. 加入1：3000(不同【tóng】公【gōng】司【sī】有不同的推荐稀释度)PBS-T稀【xī】释的HRP标记的山羊【yáng】抗人【rén】IgG，100μl /孔，室温1h。

7. PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

8. 显色，100μl /孔，颜色变深后中止显【xiǎn】色，2M硫酸在BIO-RAD酶标仪上【shàng】读数【shù】，可【kě】用ABTS，OPD，TMB等。