PCR检测步骤

1.将【jiāng】参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆【lóng】到同一个质粒载体上【shàng】，构建一种可同时用于【yú】参照【zhào】基因以及待测目【mù】的基因【yīn】扩增检【jiǎn】测的标准品【pǐn】，并【bìng】将【jiāng】所得标准品按照浓【nóng】度梯度稀释【shì】后同时【shí】用于绘制参照【zhào】基因以及待【dài】测目【mù】的基因的【de】标准【zhǔn】曲线；

2.待测【cè】样本与步【bù】骤1所述标准品经同步进【jìn】行【háng】实时荧光定量PCR扩增后【hòu】，目的基因与参照基因【yīn】按照各自的标准曲线【xiàn】计算【suàn】各自【zì】的拷贝数，计算待测样【yàng】本的目的基【jī】因与参照基【jī】因拷贝数比值，即【jí】得目的基因【yīn】的【de】拷贝数相对定【dìng】量【liàng】检测结果。

其中步骤1为【wéi】：将参照基【jī】因与待测【cè】目的基因【yīn】片段等比例连接，克【kè】隆【lóng】到同一个质粒载体上，构建一种可同【tóng】时用于参照基【jī】因以及待测目的【de】基【jī】因扩【kuò】增检【jiǎn】测的标准品，并将【jiāng】所得标准品按照浓【nóng】度梯度稀【xī】释后【hòu】同时用于绘制参照基因以及待测目的【de】基【jī】因的标准曲线【xiàn】。

其【qí】中所述【shù】参照基因为本领【lǐng】域常规参【cān】照【zhào】基【jī】因，较佳地【dì】管家基因，优选地为【wéi】RPPH1的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域【yù】常规质粒载体，较【jiào】佳地为PCR克隆载【zǎi】体，优选地为TA cloning载体，所述TA cloning载体较佳地为【wéi】pMD18-T载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示【shì】。所述【shù】的等比例【lì】较佳地【dì】为1：1。由于标准品中【zhōng】待测目的基因与参照【zhào】基【jī】因的【de】比例为【wéi】1:1，解决了【le】目【mù】前相对标准曲线法【fǎ】应用中目的基因与参照基因的浓度【dù】比例【lì】关【guān】系难以控制【zhì】的问【wèn】题，提高HER2基因扩增检测的【de】可靠性【xìng】。

步【bù】骤2为：待测样本【běn】与步骤(1)所述【shù】标准品经同步进行实时荧光【guāng】定量PCR扩增【zēng】后，目的基【jī】因与参照基因【yīn】按照各自的标准曲【qǔ】线【xiàn】计算各自的【de】拷贝【bèi】数，计【jì】算【suàn】待测样【yàng】本的【de】目的基因与参照基因拷贝数比值，即得【dé】目的基因的拷贝数相对定量检【jiǎn】测结果。

其中所述待测目【mù】的基因为【wéi】本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或【huò】者【zhě】疾病的特异性【xìng】基【jī】因，更【gèng】佳地【dì】为HER2基因的扩增【zēng】区域，所述【shù】荧光【guāng】定量PCR扩【kuò】增为本【běn】领域常规荧光【guāng】定量PCR扩增方法，所述荧光定量PCR扩增方法较佳地为多【duō】通【tōng】道【dào】荧光定量【liàng】PCR扩增，更佳【jiā】地为双通道荧光定【dìng】量PCR扩增。

实时【shí】荧【yíng】光定量PCR是指在【zài】PCR反【fǎn】应体系中加入荧光基团，利用荧光【guāng】信号积累实时监测整个PCR进程【chéng】，后通过【guò】标准曲线对【duì】未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原【yuán】理包括探针类和【hé】非探【tàn】针类两类，探针类是利用【yòng】与靶细胞序【xù】列特【tè】异性杂交【jiāo】的探针【zhēn】来指示【shì】扩增产【chǎn】物的增【zēng】加，非探针类是【shì】利【lì】用荧光染【rǎn】料或者【zhě】特异性【xìng】设【shè】计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA、RNA样品进行定量【liàng】（包括绝对【duì】定量和相对定量）和定性分析。

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