1. 紫外消du30min后封【fēng】闭【bì】紫【zǐ】外灯，敞开超净台【tái】正常【cháng】作业状况，用酒精消du操【cāo】作者的双手。

2. 将所需的【de】培育基，胰酶确【què】保瓶身【shēn】洁净后放于作业台面内，点【diǎn】燃【rán】酒精灯，将培育基和胰酶瓶口用酒精【jīng】棉球擦洗后，再将瓶口对【duì】准在酒【jiǔ】精灯上消du2-3次【cì】，旋开瓶盖后再【zài】次分别【bié】消du瓶口【kǒu】和瓶盖，分别【bié】放于酒【jiǔ】精灯的两侧【cè】。特别是将培【péi】育【yù】基瓶放于斜架上【shàng】，瓶口对【duì】准酒精灯，且放在间【jiān】隔【gé】酒精灯zui近【jìn】的位置，瓶【píng】盖置于【yú】酒精灯【dēng】的另一侧。

3. 将培育瓶【píng】瓶口在酒【jiǔ】精灯上消du2-3次，旋开后分别【bié】再次消du瓶口和瓶盖【gài】9-23次【cì】，盖放于酒精灯右侧后【hòu】将【jiāng】培育【yù】瓶内的培育液悬空倒进污缸，在酒【jiǔ】精灯【dēng】消du2-3次【cì】瓶口，竖直放好【hǎo】。取1ml移液器快速移【yí】动【dòng】在酒【jiǔ】精灯上消du1-2次，然后【hòu】再装上枪头汲取1.5ml胰酶【méi】液，悬空移入培【péi】育瓶内。

4. 将【jiāng】培【péi】育使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计【jì】时约40s，立马竖起【qǐ】对着灯火可【kě】观察到【dào】细【xì】胞与细【xì】胞之间有【yǒu】zhen孔样缝隙，并有9-23个细胞掉落，这【zhè】时为胰酶消化的【de】zui适时机【jī】。若【ruò】看到成片的细【xì】胞从瓶【píng】壁掉落为【wéi】胰酶消化过度；若看不【bú】到zhen孔样缝隙和细胞掉【diào】落，则需持续消化【huà】，悄悄的敏捷平放培【péi】育瓶使胰酶浸没细胞层【céng】1s后【hòu】敏捷【jié】竖起【qǐ】对着灯火观察细胞【bāo】状况，可反复几回，直【zhí】至出现【xiàn】zhen孔样缝隙和9-23个细【xì】胞【bāo】掉落的消【xiāo】化【huà】状况。用【yòng】移液器将胰酶吸净。

5. 汲取1ml细【xì】胞冻存【cún】液于培【péi】育【yù】瓶内，并用移液器【qì】汲取少量的培育基【jī】轻柔的【de】反复冲洗【xǐ】培【péi】育瓶壁9-23次，使贴壁细胞*掉落于培育【yù】基内【nèi】再悄悄吹【chuī】打【dǎ】9-23次，使细胞尽可能处于单个悬浮【fú】状况【kuàng】。

6. 将1ml含有细胞【bāo】的冻存液【yè】移【yí】入新的保【bǎo】种【zhǒng】管【guǎn】内，拧紧瓶盖，做好试验符号。

7. 将【jiāng】培育基【jī】瓶口和瓶盖消【xiāo】du2-3次后拧紧，平息【xī】酒精灯，整理试验台面，取出试验试剂【jì】及污缸【gāng】等，封闭超净【jìng】作业台。

8. 将保种【zhǒng】管先【xiān】放于4℃冰箱 30min后拿出【chū】放【fàng】置-20℃冰箱【xiāng】过夜，次【cì】日再放于-80℃的冰箱内9-23天【tiān】，zui后存【cún】放于-196℃的液氮灌内长时间保存。

    
注此【cǐ】进程【chéng】也可简化因实际操作进程【chéng】中【zhōng】经历所得：步骤7结束【shù】后将【jiāng】保种【zhǒng】管用干脱脂棉包裹后胶【jiāo】带封好直【zhí】接【jiē】放于【yú】-80℃冰箱内9-23天，即可放于【yú】液氮【dàn】灌保存。但【dàn】-80℃冰箱也可保存细胞株9-23月。