一、摘要：

1.标本的采取和保存

    可用作elisa测【cè】定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌【mì】物(唾液【yè】)和排【pái】泄物(如尿液、粪便)等均可作【zuò】标本以测【cè】定其中【zhōng】某种抗体或抗原成【chéng】份【fèn】。有些标本可【kě】直接进行测定(如血清【qīng】、尿液)，有些则需经预处理(如粪便【biàn】和某些分【fèn】泌物【wù】)。大部分ELISA检测均以血清【qīng】为标【biāo】本。血浆中除尚【shàng】含有【yǒu】纤维【wéi】蛋白原和抗凝剂【jì】外，其他成份均【jun1】同等于血清。制备血【xuè】浆标本需借助于抗凝【níng】剂【jì】，而血清标【biāo】本只要【yào】待血清自然凝固、血kuai收缩后即可取得【dé】。除【chú】特殊情况外【wài】，在医学【xué】检验中均以血清作为【wéi】检【jiǎn】测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应【yīng】用。血清标本可按常规方法采集，应注【zhù】意避【bì】免【miǎn】溶血，红细【xì】胞溶解【jiě】时【shí】会释【shì】放出【chū】具有【yǒu】过氧【yǎng】化物酶活性的物质，以HRP为【wéi】标记的ELISA测定中，溶血【xuè】标本可能会增加非特异【yì】性【xìng】显色。 血清标本宜在新鲜时检测【cè】。如有细菌污染【rǎn】，菌体中可【kě】能含【hán】有内源性HRP，也会产生假阳【yáng】性【xìng】反应。如【rú】在冰【bīng】箱中保存过久，其【qí】中的可发生【shēng】聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内【nèi】测定的血清标本可放置于4℃，超过一周【zhōu】测【cè】定的需低温冰存。冻【dòng】结【jié】血清【qīng】融解【jiě】后【hòu】，蛋白质【zhì】局【jú】部【bù】浓缩【suō】，分【fèn】布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上【shàng】下颠倒混和，不要【yào】在【zài】混匀器上强烈【liè】振荡。混浊或【huò】有沉淀的【de】血清【qīng】标本应先【xiān】离心或【huò】过滤【lǜ】，澄清后再检【jiǎn】测。反复冻融会使【shǐ】抗体【tǐ】效【xiào】价跌落，所以测抗体的血清标本【běn】如需保【bǎo】存作多次检测，宜少量分装冰存。保【bǎo】存血清自【zì】采集时就应注意无菌操作，也可加入适【shì】当防腐剂。

2.加样 

在ELISA中一【yī】般【bān】有3次加【jiā】样步【bù】聚，即加标本，加酶【méi】结合【hé】物，加底物。加【jiā】样时应将所加物加在LEISA板孔【kǒng】的底部，避【bì】免加在【zài】孔【kǒng】壁上部，并注意不可溅出，不可产生【shēng】气【qì】泡。 加标本一般用【yòng】微量加【jiā】样器，按规【guī】定的量加入板孔【kǒng】中。每次加标本应更换吸嘴【zuǐ】，以免发生交叉污【wū】染，也可用一【yī】次性的定量塑料【liào】管加样。有此测定(如【rú】间接法ELISA)需用稀释的【de】血【xuè】清，可在试管中按【àn】规【guī】定的【de】稀释度稀释后再加样。也可在板孔【kǒng】中加入稀【xī】释液【yè】，再在其中【zhōng】加入血清标本，然后【hòu】在微型震【zhèn】荡【dàng】器上震【zhèn】荡1分钟【zhōng】以保证混和。加【jiā】酶结合物应用液和底【dǐ】物应用液时可用定量多道加液器，使加【jiā】液过程迅【xùn】速完【wán】成。

3.试剂的准备 

    按【àn】试剂盒说明【míng】书的要求准备实验【yàn】中需用的试剂【jì】。ELISA中用的【de】蒸馏水【shuǐ】或去离子【zǐ】水，包括用【yòng】于【yú】洗涤的，应为新鲜的和高质【zhì】量的。自配的【de】缓冲液应用【yòng】pH计测量较正。从冰箱【xiāng】中取【qǔ】出的【de】试验【yàn】用试剂【jì】应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试【shì】验不【bú】需用的【de】部分应及时放回冰箱保存。

4. 保温

在ELISA中一般有两次抗原抗【kàng】体反应，即加标本【běn】和加酶结合物后【hòu】。抗原抗体反应【yīng】的完【wán】成需要有一定的【de】温度和【hé】时间【jiān】，这一【yī】保温【wēn】过程称【chēng】为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫【yì】测定，抗原、抗体的结【jié】合【hé】只在【zài】固相【xiàng】表【biǎo】面上发生。以【yǐ】抗体包【bāo】被的夹心法为例【lì】，加【jiā】入板孔中的标本，其中的抗【kàng】原【yuán】并不是【shì】都【dōu】有均等的【de】和固相【xiàng】抗结合【hé】的机会，只有zui贴近【jìn】孔壁的一层溶液【yè】中的抗原【yuán】直接与抗体接触。这是一【yī】个逐步平衡的过程，因【yīn】此【cǐ】需经扩【kuò】散才能达到反应的终点。在其【qí】后加入的酶标【biāo】记抗【kàng】体与固相抗原的结合也【yě】同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一【yī】定时【shí】间的温育。
    温育【yù】常采用的【de】温度有43℃、37℃、室温【wēn】和4℃(冰【bīng】箱温度)等。37℃是实验室中常【cháng】用的保温温度，也是大多【duō】数抗原抗【kàng】体【tǐ】结合的合适【shì】温度。在建立【lì】ELISA方法作反【fǎn】应动力学研究时【shí】，实【shí】验表明，两次抗原【yuán】抗【kàng】体反【fǎn】应一般在37℃经【jīng】9-23小时，产物【wù】的可达。为【wéi】加【jiā】速反应，可提高反应的温度，有些试验在【zài】43℃进行，但【dàn】不宜【yí】采用更高的温度。抗原【yuán】抗体反应4℃更为*，以形成【chéng】zui多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。