细胞冻存及复苏【sū】的【de】基本原则是慢冻快融，实【shí】验证明这【zhè】样【yàng】可以大【dà】限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或【huò】二甲基亚砜【fēng】作保【bǎo】护剂【jì】，这两【liǎng】种物质能提高细胞膜对水的通【tōng】透性，加上缓慢【màn】冷冻可使【shǐ】细【xì】胞内的【de】水【shuǐ】分渗出【chū】细胞外，减少【shǎo】细胞内【nèi】冰晶的【de】形成，从而减少由【yóu】于冰【bīng】晶形成【chéng】造成的细胞损伤。复苏【sū】细胞应【yīng】采用快速融【róng】化的方法，这样可以【yǐ】保证细胞【bāo】外结晶【jīng】在很短的时【shí】间内即【jí】融【róng】化【huà】，避免【miǎn】由【yóu】于缓慢融化使水【shuǐ】分渗入细胞内形成胞【bāo】内再结晶对细胞造成损【sǔn】伤【shāng】。细胞复苏【sū】是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操【cāo】作中注【zhù】意细小问题【tí】，才能使复苏后的细胞【bāo】状态保持良好，针对细胞复【fù】苏，1. 可以提前把需【xū】要的体积的培养液放【fàng】到培养瓶里，拧松【sōng】瓶盖，放到孵箱里【lǐ】半小时到1小时； 2. 为防止【zhǐ】冻【dòng】存管在【zài】升温时爆【bào】裂等，可以在放入水浴前就实现在【zài】超净台里把盖子拧松一下【xià】然【rán】后再拧上； 3. 水【shuǐ】浴温【wēn】度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说【shuō】37℃。
一、冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞【bāo】冷【lěng】到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞【bāo】中可溶性物【wù】质浓度【dù】升高，并在细【xì】胞内形【xíng】成冰【bīng】晶。
如果缓慢冷冻，可使【shǐ】细【xì】胞逐步脱水，细胞内不【bú】致产生大的冰【bīng】晶；相【xiàng】反，结晶就大【dà】，大结【jié】晶会造成细胞【bāo】膜、纲胞【bāo】器的【de】损伤【shāng】和破裂。复苏【sū】过程应快融【róng】，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重【chóng】结晶。
二、慢冻程序
1.  标准程序：采用细胞冻存器
当温度在-25 ℃以上时，  1~2 ℃/min；
当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2.  简易【yì】程序：将冷【lěng】冻管（管口要朝上）放入纱布【bù】袋内，纱【shā】布袋系以线绳，通过【guò】线绳将纱布袋固定于液【yè】氮罐罐【guàn】口，按每分钟温【wēn】度下降1~2 ℃的速度，在【zài】40 min内降至液氮【dàn】表面过【guò】夜，次晨投人液氮中。
3.  传统程序：冷冻管【guǎn】置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜【yè】） → 液【yè】氮槽长【zhǎng】期【qī】储存【cún】。
三、低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常【cháng】用【yòng】的低温保护剂是DMSO，它是一【yī】种渗透性保护剂【jì】，可迅速透入细【xì】胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水【shuǐ】分在冻【dòng】结【jié】前透【tòu】出细胞外【wài】，在【zài】胞【bāo】外形成冰晶，减少【shǎo】胞【bāo】内冰【bīng】晶，从而减少冰晶对细胞【bāo】的损伤。
四、细胞冻存方法
1.  预先配制冻存液
（1）10%DMSO + 细【xì】胞生长液（20%血【xuè】清【qīng】+基础【chǔ】培养液）
（2）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）
2.  取【qǔ】对【duì】数生长期细胞【bāo】，经胰酶消化后，加【jiā】入【rù】适量冻存液， 用吸管吹打【dǎ】制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细【xì】胞/ml）。
3.  加【jiā】入1 ml细胞于冻【dòng】存管中，密封【fēng】后标记冷【lěng】冻细胞【bāo】名【míng】称和冷冻日期。液氮长期保存。
五、保存细胞的复苏方法
1.  快速解冻
冻存细胞从【cóng】液氮中取出后，立即放入【rù】37℃水浴【yù】中，轻【qīng】轻【qīng】摇动冷冻管，使其在【zài】1 分钟内全部融【róng】化（不要超过3 分钟）。
2.  解【jiě】冻后【hòu】的细【xì】胞可直接接种到含*生长培养液的细胞培养【yǎng】瓶中【zhōng】直接进【jìn】行培【péi】养，24小时后再用新鲜*培【péi】养液替换旧培【péi】养【yǎng】液，以去除DMSO。
3.  如果细胞对冷冻保护剂特别敏感
解冻后的细胞【bāo】应先通过离心【xīn】去【qù】除【chú】冷冻保【bǎo】护剂【jì】，然后再接种【zhǒng】到含*生【shēng】长培养液的培养瓶中。