本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒【hé】用于体外【wài】定【dìng】量检【jiǎn】测血清、血【xuè】浆、组织【zhī】匀浆及【jí】相关液体样本中大鼠信号素4D(SEMA4D)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大【dà】量正常标【biāo】本检【jiǎn】验，标本的正常浓度值均在试剂【jì】盒提【tí】供的检测范【fàn】围内，实验过程中直【zhí】接取50μL样本上样即可【kě】。当有【yǒu】部分样本值超过标准品浓【nóng】度时，可用样本稀释液将【jiāng】标【biāo】本进【jìn】行适当稀【xī】释后再进【jìn】行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取出【chū】的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现【xiàn】象【xiàng】；放【fàng】置室温，轻摇均匀，待结晶【jīng】溶【róng】解【jiě】后再配置洗涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤液用蒸【zhēng】馏水或去离子水稀释配置【zhì】成400ml工作【zuò】浓【nóng】度的洗涤液，未用【yòng】完的放回【huí】4℃

3. 20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水按1：20稀释，即1份【fèn】20×洗涤缓冲液加【jiā】19份蒸馏【liú】水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往【wǎng】预先包被大鼠信号素4D(SEMA4D)捕获抗体的包被微【wēi】孔【kǒng】中，依次加入标本【běn】、标准品、HRP标记的检【jiǎn】测抗体，经【jīng】过温育洗【xǐ】涤。用底物TMB显色，TMB在过氧【yǎng】化物【wù】酶的催化【huà】下转【zhuǎn】化成蓝色，并【bìng】在酸的【de】作用下转化成黄色。颜【yán】色的【de】深浅和样【yàng】品中的大鼠信号素4D(SEMA4D)呈正【zhèng】相关。用【yòng】酶【méi】标仪在450nm 波【bō】长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时【shí】或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即【jí】可，或【huò】将【jiāng】上清置【zhì】于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融【róng】。

2. 血浆：用EDTA或肝【gān】素作【zuò】为抗凝【níng】剂采集标本，并【bìng】将标本在【zài】采集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离【lí】心15分钟，取上【shàng】清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避【bì】免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去【qù】除残留【liú】血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将【jiāng】剪【jiǎn】碎的组【zǔ】织与对应体积的PBS（一般【bān】按1:9的【de】重量体积比，比如1g的组织【zhī】样品对应9mL的【de】PBS，具体体积可根【gēn】据实验需要适【shì】当调整，并做好记录。推【tuī】荐在【zài】PBS中【zhōng】加入蛋白酶抑【yì】制剂）加入【rù】玻璃匀浆【jiāng】器【qì】中，于冰上充分【fèn】研磨【mó】。为【wéi】了进一步裂解组织【zhī】细【xì】胞，可以【yǐ】对匀浆液进行超声破碎，或【huò】反复冻融。将匀浆液于【yú】5000×g离心【xīn】5~10分钟，取【qǔ】上清检【jiǎn】测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离【lí】心20分钟，取上【shàng】清即可检测，或将【jiāng】上清置【zhì】于【yú】-20℃或-80℃保存【cún】，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行【háng】检测的可保【bǎo】存【cún】于【yú】4℃，若不能及时检测【cè】，请按一次使用【yòng】量【liàng】分装，冻【dòng】存【cún】于-20℃（1个月【yuè】内检【jiǎn】测），或-80℃（6个月内检测），避免反复【fù】冻融，标本溶血会影响【xiǎng】检【jiǎn】测结果，因此溶血标本【běn】不宜进行【háng】此【cǐ】项检测。

注意事项：

1. 严格按照规定的时间和温度【dù】进【jìn】行温育以保证准【zhǔn】确结果。所【suǒ】有试剂都【dōu】必须在【zài】使用【yòng】前达到室温【wēn】9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可【kě】以导致不准确的结果。在加【jiā】入底【dǐ】物前【qián】确保【bǎo】尽量吸干【gàn】孔内液体【tǐ】。温育过程中【zhōng】不【bú】要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反【fǎn】应试剂不能【néng】接触漂白溶剂【jì】或漂白溶剂所散发的强烈【liè】气【qì】体。任何漂白成【chéng】分【fèn】都会破【pò】坏试剂盒中反【fǎn】应试剂【jì】的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所【suǒ】有的样品都应【yīng】管理【lǐ】好，按照规定【dìng】的程序处理【lǐ】样品和检测装【zhuāng】置。

操作步骤：

1．从【cóng】室温平衡60min后【hòu】的铝箔袋中取出所需板条，剩余【yú】板条用【yòng】自封【fēng】袋密封放【fàng】回4℃。

2．设置标准品孔和样【yàng】本孔，标准品【pǐn】孔各加不【bú】同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔外，标准品孔和样本孔中每【měi】孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记【jì】的检测【cè】抗体100μL，用封【fēng】板膜封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或恒温【wēn】箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液体，吸水【shuǐ】纸【zhǐ】上拍干，每【měi】孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去【qù】洗【xǐ】涤液，吸【xī】水纸上拍干，如此重复洗板5次（也【yě】可【kě】用洗板【bǎn】机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处【chù】测【cè】定各【gè】孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表中，以【yǐ】标准品浓度作【zuò】横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制【zhì】出标准品【pǐn】线性回归曲线，按曲【qǔ】线【xiàn】方【fāng】程计算各样【yàng】本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了【le】避免交叉感染，配置不同浓度【dù】标准【zhǔn】品【pǐn】、上样【yàng】、加不同试剂都需要更换枪头【tóu】。另【lìng】外不同试【shì】剂请分别使用不同的移液槽【cáo】。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显【xiǎn】色底物在上板【bǎn】前应为【wéi】无色，请避光保存【cún】；假如微孔【kǒng】板【bǎn】后，将由物【wù】色变成不同深度的蓝色【sè】。

5. 终【zhōng】止液【yè】上板顺序应同显色【sè】底物上板顺序一致；加入终【zhōng】止液后【hòu】，孔内颜色由蓝变黄；若孔【kǒng】内有绿【lǜ】色，则【zé】表明【míng】孔内液体未混匀【yún】；请充分混合。

说明：

1. 由于现有条件【jiàn】及科【kē】学技术【shù】水平尚不【bú】能对所【suǒ】有供货商提供的【de】所有原【yuán】料进行全面的【de】鉴【jiàn】定与分析，本产品可能存在一【yī】定的质量技术风险【xiǎn】。

2. 实验结果【guǒ】与试剂【jì】的【de】有效性、实验【yàn】者【zhě】的相关【guān】操【cāo】作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标【biāo】本备份。

3. 不同批次的同【tóng】一产品可能会有少许差【chà】别，如：检测【cè】限、灵敏度以及显色【sè】时间等，请依据试剂【jì】盒内说明书进行实验操作，网【wǎng】站电【diàn】子版【bǎn】说明书仅作【zuò】参考【kǎo】。

4. 只有【yǒu】全部使用【yòng】本试剂盒【hé】配套试剂才能保证检测【cè】效果，不能混用其他制【zhì】造商的【de】产品【pǐn】。只有【yǒu】严格遵守本试剂【jì】盒【hé】的实【shí】验说明才会得到检测结果。