本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外定量检测【cè】血清【qīng】、血浆、组【zǔ】织匀浆及相关液体样本中大【dà】鼠【shǔ】血管内皮生【shēng】长因【yīn】子【zǐ】A(VEGFA)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量【liàng】正常标本检验，标本的正常浓度值均在【zài】试剂盒【hé】提【tí】供的检测范围内，实验过程中【zhōng】直接【jiē】取【qǔ】50μL样本上样【yàng】即可。当【dāng】有部【bù】分样本值超过【guò】标准【zhǔn】品浓度时，可用样本稀释液将标本进【jìn】行适当稀释【shì】后再【zài】进行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从【cóng】冰箱中【zhōng】取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于【yú】正【zhèng】常现象；放置室【shì】温，轻摇均匀，待【dài】结晶溶解后【hòu】再配置【zhì】洗涤【dí】液。可将20ml浓缩【suō】洗涤液用蒸馏【liú】水或去离子水稀释配【pèi】置成400ml工作浓度的【de】洗涤液，未用完【wán】的放【fàng】回4℃

3. 20×洗涤缓冲液的稀【xī】释：蒸馏水按1：20稀释【shì】，即1份【fèn】20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预【yù】先包被大鼠血管【guǎn】内【nèi】皮生长因子A(VEGFA)捕获抗体的包被微孔中【zhōng】，依【yī】次加入标【biāo】本、标【biāo】准品、HRP标记的检测抗体，经过【guò】温【wēn】育洗【xǐ】涤。用底物TMB显色【sè】，TMB在过【guò】氧化物酶的催化【huà】下转【zhuǎn】化成蓝色，并在【zài】酸的作【zuò】用下转化成黄色。颜色【sè】的深浅和样品中的【de】大鼠血管内皮生长因子A(VEGFA)呈正相【xiàng】关。用酶标仪在450nm 波长下【xià】测定吸光【guāng】度（OD 值），计算样【yàng】品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜【yè】，然后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上【shàng】清即可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应【yīng】避免反复冻【dòng】融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为【wéi】抗凝剂采【cǎi】集标本，并将标【biāo】本在采集后的30分【fèn】钟内于9-21℃ 1000×g离心15分【fèn】钟【zhōng】，取上清即可检【jiǎn】测，或将【jiāng】上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗组织，去除残【cán】留血【xuè】液【yè】（匀浆【jiāng】中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织【zhī】剪碎。将剪碎的组织【zhī】与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应【yīng】9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验需要【yào】适当【dāng】调整，并做好记录。推荐【jiàn】在PBS中加入【rù】蛋白酶抑【yì】制【zhì】剂）加【jiā】入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为【wéi】了进【jìn】一步裂解组【zǔ】织细【xì】胞【bāo】，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。将匀浆液【yè】于【yú】5000×g离心5~10分钟，取上清检【jiǎn】测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可【kě】检测，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复冻【dòng】融【róng】。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行【háng】检测的可保存于4℃，若【ruò】不能及【jí】时检测，请按一【yī】次使用量分装，冻存于-20℃（1个【gè】月内【nèi】检测），或-80℃（6个月内检测），避【bì】免【miǎn】反复冻融，标【biāo】本【běn】溶血会【huì】影响检测结【jié】果【guǒ】，因此溶血【xuè】标【biāo】本不宜进行此项检测。

注意事项：

1. 严格按照【zhào】规定的【de】时间和温度进【jìn】行【háng】温育以保证【zhèng】准确结果。所有试剂【jì】都必须在使用前【qián】达到室【shì】温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板【bǎn】不正确可以【yǐ】导致不【bú】准确的【de】结果。在加入底物前确【què】保尽量吸干【gàn】孔内液【yè】体。温育过程中不要让微【wēi】孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触【chù】漂白溶剂【jì】或漂白溶剂所散发的强烈气【qì】体。任何漂白成分【fèn】都【dōu】会破坏【huài】试【shì】剂盒中反应试【shì】剂的生物活性【xìng】。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾【jí】病，所有的样品都应【yīng】管理【lǐ】好，按照规定【dìng】的程序处理样品【pǐn】和检【jiǎn】测【cè】装置。

操作步骤：

1．从【cóng】室温平衡60min后的铝箔袋中【zhōng】取【qǔ】出【chū】所需板条，剩余板条【tiáo】用【yòng】自封袋【dài】密封放回4℃。

2．设置标准品【pǐn】孔和样【yàng】本孔，标【biāo】准品孔各加【jiā】不同【tóng】浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白【bái】孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化【huà】物酶（HRP）标【biāo】记的【de】检测抗体100μL，用封板膜封【fēng】住反应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或恒温【wēn】箱温育60min。

5．弃【qì】去液体，吸水【shuǐ】纸上拍【pāi】干【gàn】，每【měi】孔【kǒng】加【jiā】满洗涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤液【yè】，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次【cì】（也可用洗【xǐ】板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入【rù】终止液50μL，15min内，在450nm波【bō】长【zhǎng】处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作【zuò】表中，以【yǐ】标准品浓度【dù】作【zuò】横坐标，对应OD值作纵【zòng】坐标，绘【huì】制出【chū】标准品【pǐn】线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉【chā】感染，配置【zhì】不同浓【nóng】度标准【zhǔn】品、上样、加不同试剂都【dōu】需要更换枪头。另外不同【tóng】试【shì】剂请【qǐng】分别【bié】使用不【bú】同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合【hé】后【hòu】的显色底物在上板前应为无色【sè】，请避【bì】光保存；假如微孔板后，将由物色变【biàn】成【chéng】不同深度的蓝【lán】色。

5. 终止液上【shàng】板顺序应同显色底【dǐ】物上板顺序【xù】一【yī】致；加入【rù】终止【zhǐ】液【yè】后，孔内颜色由【yóu】蓝变黄；若孔【kǒng】内有【yǒu】绿色，则表明孔内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1. 由【yóu】于现有条【tiáo】件及科【kē】学技【jì】术水平尚不能对所有供【gòng】货商提供的所有【yǒu】原料进行全【quán】面的鉴定与分析，本【běn】产【chǎn】品可【kě】能存在一定的质量技【jì】术风险。

2. 实验结【jié】果与试剂【jì】的【de】有【yǒu】效性【xìng】、实验者的相关操【cāo】作【zuò】以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的【de】标【biāo】本备份。

3. 不同批次的同一产品可能【néng】会有少许差【chà】别【bié】，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试【shì】剂盒【hé】内【nèi】说明书进行【háng】实验【yàn】操作【zuò】，网站电子【zǐ】版说明书仅作参考。

4. 只有全部【bù】使用本试【shì】剂盒配套试【shì】剂才【cái】能保证【zhèng】检测效果，不能混用其他【tā】制造【zào】商【shāng】的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说【shuō】明才会【huì】得到检测结【jié】果。