本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外定【dìng】量【liàng】检测血清、血浆、组织匀【yún】浆及【jí】相关液【yè】体样【yàng】本中大鼠周期素【sù】依赖性激【jī】酶5(CDK5)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量正常标本检验，标本的【de】正常浓度值均在试【shì】剂盒提供的检测范围内【nèi】，实验【yàn】过【guò】程【chéng】中直接【jiē】取50μL样本【běn】上样即可。当有【yǒu】部分样本值超过【guò】标准品【pǐn】浓度【dù】时，可用样本稀释液将【jiāng】标本进【jìn】行适当稀释后再进行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰【bīng】箱中取出的浓缩洗涤液可【kě】能有结【jié】晶，属于正【zhèng】常【cháng】现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后【hòu】再配置【zhì】洗涤液。可将【jiāng】20ml浓缩洗【xǐ】涤液【yè】用蒸馏【liú】水【shuǐ】或去离子水稀释配置成400ml工【gōng】作浓度的洗涤液，未用完【wán】的放回【huí】4℃

3. 20×洗【xǐ】涤缓【huǎn】冲液【yè】的稀释：蒸馏水按1：20稀【xī】释，即1份20×洗【xǐ】涤缓冲【chōng】液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠周【zhōu】期【qī】素依【yī】赖性激酶5(CDK5)捕获抗【kàng】体【tǐ】的包被微孔中，依【yī】次加入标【biāo】本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育洗涤。用【yòng】底【dǐ】物TMB显【xiǎn】色，TMB在【zài】过氧化【huà】物酶的【de】催化【huà】下【xià】转【zhuǎn】化成蓝色，并在酸【suān】的作用下转化成黄色。颜色【sè】的深【shēn】浅【qiǎn】和样品中的大鼠周期素【sù】依【yī】赖性激酶【méi】5(CDK5)呈【chéng】正相关【guān】。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值【zhí】），计算样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小【xiǎo】时或4℃过夜，然【rán】后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上【shàng】清置于-20℃或【huò】-80℃保【bǎo】存，但应避免反复冻【dòng】融【róng】。

2. 血浆：用EDTA或【huò】肝素作【zuò】为抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在采集后【hòu】的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟，取上【shàng】清即可检测【cè】，或【huò】将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存【cún】，但【dàn】应避免反复冻【dòng】融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组织，去除【chú】残留血液（匀浆【jiāng】中【zhōng】裂解的红细胞【bāo】会影响测量结【jié】果），称重后将组织【zhī】剪碎【suì】。将剪碎的组织【zhī】与对应体积的PBS（一【yī】般按1:9的【de】重量体积比，比如1g的组【zǔ】织样品对应9mL的PBS，具体体【tǐ】积可【kě】根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐【jiàn】在【zài】PBS中加【jiā】入蛋白酶【méi】抑制剂）加入玻璃【lí】匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进【jìn】一步裂解组织细胞，可以对【duì】匀浆液【yè】进【jìn】行超声破碎，或反【fǎn】复冻融。将匀浆【jiāng】液于【yú】5000×g离心【xīn】5~10分钟，取【qǔ】上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于【yú】-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应避免反【fǎn】复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行【háng】检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请【qǐng】按一次【cì】使用量分装，冻【dòng】存于-20℃（1个月【yuè】内检【jiǎn】测），或-80℃（6个月内检测【cè】），避免反复冻融，标【biāo】本【běn】溶【róng】血会影响检测结果，因此溶血【xuè】标【biāo】本不宜进【jìn】行【háng】此项检测。

注意事项：

1. 严【yán】格按照规定的时【shí】间和温度进行温【wēn】育以【yǐ】保证准确结【jié】果【guǒ】。所有试剂都必须在【zài】使用前达到【dào】室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不【bú】正确可【kě】以导【dǎo】致不准确的结果【guǒ】。在加入底物前【qián】确保【bǎo】尽量吸干【gàn】孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉【diào】。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反【fǎn】应试【shì】剂【jì】不能接触漂白溶剂或漂白【bái】溶剂所散发的强烈气体【tǐ】。任何【hé】漂白【bái】成分都会【huì】破坏试剂【jì】盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可【kě】能传播疾病，所有的样品都应管【guǎn】理【lǐ】好，按照【zhào】规定的程序【xù】处理样【yàng】品和检测装【zhuāng】置。

操作步骤：

1．从室温平衡【héng】60min后的铝箔【bó】袋中【zhōng】取出所【suǒ】需板条，剩【shèng】余板条用自封袋密封放回【huí】4℃。

2．设置标【biāo】准品孔和样本孔，标准品孔各【gè】加不同浓【nóng】度的标准品【pǐn】50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白孔外【wài】，标准品【pǐn】孔和样本孔中每孔加入辣【là】根过氧化【huà】物酶（HRP）标记的检【jiǎn】测抗体【tǐ】100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅【guō】或恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍【pāi】干，每孔加满洗涤液（350μL），静置【zhì】1min，甩去洗涤液【yè】，吸【xī】水纸上拍干【gàn】，如此【cǐ】重复洗板5次（也可用【yòng】洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加入终【zhōng】止液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以【yǐ】标准品浓【nóng】度【dù】作横【héng】坐标，对应【yīng】OD值作【zuò】纵坐标，绘制出标准【zhǔn】品线【xiàn】性回归曲线，按曲线方程计算各【gè】样本浓度值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了【le】避免交【jiāo】叉感染【rǎn】，配置不同浓度标【biāo】准品、上样、加不同【tóng】试剂都需要更换枪头。另外不同试剂【jì】请分【fèn】别使用不同的【de】移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合【hé】后的显色底【dǐ】物在上板前应【yīng】为【wéi】无色，请避光【guāng】保存；假如微孔板后，将【jiāng】由物色【sè】变成【chéng】不同深度的蓝色。

5. 终【zhōng】止液上板顺序应同显色底【dǐ】物【wù】上【shàng】板顺【shùn】序一【yī】致；加入终止液【yè】后，孔内【nèi】颜色由蓝变黄；若孔内有绿色，则【zé】表明孔内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1. 由【yóu】于现有条件及【jí】科学技术水平【píng】尚不能对所有【yǒu】供货商提供【gòng】的所有【yǒu】原【yuán】料进行【háng】全面的鉴定与分析，本【běn】产品可能存在一定的质量【liàng】技术风险。

2. 实验结【jié】果【guǒ】与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实【shí】验环境密切【qiē】相【xiàng】关【guān】，请【qǐng】务必准备充足【zú】的标本备份。

3. 不【bú】同批次的同一【yī】产品可能【néng】会有【yǒu】少许差别【bié】，如：检测限、灵敏度以及【jí】显色时间【jiān】等，请依【yī】据试剂盒内【nèi】说明书进行实验操作，网站电子版说明书【shū】仅作【zuò】参考。

4. 只有全部【bù】使用本试剂盒【hé】配套试剂才能【néng】保证检测效果，不能混【hún】用其他【tā】制【zhì】造【zào】商的产品。只有【yǒu】严格遵守【shǒu】本试剂盒【hé】的实验说明才会得到检测结果。