本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外【wài】定量检测血【xuè】清、血浆、组【zǔ】织匀【yún】浆及相关液体样【yàng】本中大【dà】鼠诱导型NO合酶(iNOS)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过【guò】大量正常标本检验，标本的正【zhèng】常【cháng】浓度值均【jun1】在试剂盒提供的检【jiǎn】测范围内，实【shí】验过程中【zhōng】直接取50μL样【yàng】本上样即可。当有【yǒu】部【bù】分样本值【zhí】超过标准品浓度时，可【kě】用【yòng】样本稀释液将标本进行适当【dāng】稀释后再进行【háng】实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取出【chū】的浓缩【suō】洗涤液可能有结晶，属于正常现象【xiàng】；放置室温，轻摇均匀【yún】，待结【jié】晶【jīng】溶解【jiě】后再配置洗【xǐ】涤液。可【kě】将20ml浓缩洗涤液用【yòng】蒸馏【liú】水或去离子水【shuǐ】稀释配置成【chéng】400ml工作浓【nóng】度的洗涤【dí】液，未用完【wán】的放回4℃

3. 20×洗涤缓【huǎn】冲液的【de】稀释【shì】：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液【yè】加【jiā】19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先【xiān】包【bāo】被大鼠诱导型NO合【hé】酶(iNOS)捕获【huò】抗体的包被微孔中，依次加入标本【běn】、标准品、HRP标记【jì】的【de】检测【cè】抗体，经过温育洗【xǐ】涤。用【yòng】底物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧化物酶的催化【huà】下转化成蓝色，并【bìng】在酸的【de】作用下转【zhuǎn】化成黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠诱【yòu】导型【xíng】NO合酶【méi】(iNOS)呈正相关。用酶【méi】标【biāo】仪在【zài】450nm 波长下测定【dìng】吸光度（OD 值），计【jì】算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离【lí】心【xīn】20 分钟，取【qǔ】上清即可，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保存【cún】，但应避免反复冻【dòng】融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在采集后【hòu】的30分钟内【nèi】于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟，取上清【qīng】即可【kě】检测，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存【cún】，但应【yīng】避免反复冻【dòng】融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去【qù】除【chú】残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测【cè】量【liàng】结果【guǒ】），称【chēng】重【chóng】后将【jiāng】组织剪碎。将剪碎的组【zǔ】织【zhī】与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对【duì】应9mL的【de】PBS，具体体积可根据实验需要适【shì】当【dāng】调整，并做好记录。推荐在【zài】PBS中【zhōng】加入蛋白酶抑【yì】制剂）加入玻璃【lí】匀浆【jiāng】器中，于冰上充分研【yán】磨。为了进一步裂解组织细【xì】胞，可以对匀浆【jiāng】液进【jìn】行超【chāo】声破碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取上清【qīng】检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上【shàng】清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复【fù】冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存【cún】于4℃，若【ruò】不能及【jí】时检测，请按【àn】一次【cì】使用【yòng】量分【fèn】装，冻存于【yú】-20℃（1个月内【nèi】检测），或-80℃（6个月内【nèi】检测），避免反【fǎn】复冻融，标本【běn】溶血会影响检测结果，因此溶血标本不【bú】宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1. 严格按照规定【dìng】的时间【jiān】和温度进【jìn】行温育以保证准确结果【guǒ】。所有试剂【jì】都必【bì】须在使用前达【dá】到【dào】室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗【xǐ】板不【bú】正确可以导【dǎo】致不准确【què】的【de】结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体【tǐ】。温育过程【chéng】中不要让【ràng】微孔【kǒng】干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反【fǎn】应试剂不能接触漂白溶剂或漂白【bái】溶剂【jì】所散发的强烈气体。任何漂白【bái】成分都【dōu】会破【pò】坏【huài】试剂盒【hé】中反【fǎn】应试剂的生物【wù】活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如【rú】果可能【néng】传播疾病，所【suǒ】有的样品都应管理【lǐ】好，按照规定的程序【xù】处理样品和【hé】检测装置【zhì】。

操作步骤：

1．从室温【wēn】平衡60min后的铝【lǚ】箔袋中【zhōng】取出所需【xū】板条，剩余【yú】板条用自封袋密【mì】封放回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准品孔各加不【bú】同浓度的【de】标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔外，标准品【pǐn】孔和样本孔中每孔加入辣根过【guò】氧化物酶（HRP）标记的检测抗体【tǐ】100μL，用封板【bǎn】膜封住反【fǎn】应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或恒温箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液【yè】体，吸【xī】水纸上拍【pāi】干，每孔加【jiā】满洗涤液（350μL），静置1min，甩去【qù】洗涤液，吸水纸上【shàng】拍干，如此重复洗板5次【cì】（也可用【yòng】洗【xǐ】板机洗【xǐ】板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终【zhōng】止液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测【cè】定各孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表中，以标准品浓度作横【héng】坐标，对应【yīng】OD值作纵坐标【biāo】，绘【huì】制出标准品线【xiàn】性回归曲【qǔ】线，按曲线方程计算各样本浓度【dù】值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉感染，配置不同【tóng】浓度标准品、上【shàng】样、加【jiā】不同试剂都需要【yào】更换【huàn】枪头。另外【wài】不【bú】同试剂【jì】请分别使用不同的移液【yè】槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显色底【dǐ】物在上板前【qián】应【yīng】为无色，请避光保存；假【jiǎ】如微孔板后，将由物色变成【chéng】不【bú】同深度的蓝色。

5. 终止液上板【bǎn】顺序应同显色底【dǐ】物上板顺序【xù】一致【zhì】；加入终止液【yè】后，孔内颜色由蓝变黄；若孔【kǒng】内有绿【lǜ】色，则表明【míng】孔内液体未混【hún】匀【yún】；请充分混合。

说明：

1. 由【yóu】于现有条件及科学技术水平尚不【bú】能【néng】对【duì】所有供【gòng】货商提供的所有原【yuán】料【liào】进【jìn】行全【quán】面的【de】鉴【jiàn】定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

2. 实验结果与试剂【jì】的【de】有【yǒu】效性、实【shí】验者的相关【guān】操作以【yǐ】及当【dāng】时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标【biāo】本备份。

3. 不同【tóng】批次的同【tóng】一产品可能【néng】会有少许差别，如：检测【cè】限、灵敏度【dù】以及显【xiǎn】色时【shí】间【jiān】等，请依【yī】据试剂盒内【nèi】说明【míng】书进行实验操作，网站电子版说明书仅【jǐn】作参考。

4. 只有全部使用本试剂盒配套试【shì】剂才【cái】能保证检测效【xiào】果，不【bú】能【néng】混用其【qí】他【tā】制造【zào】商的产品【pǐn】。只有严格遵守本试剂盒【hé】的实验说明才【cái】会得到检测结果。