本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用【yòng】于体外定【dìng】量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样【yàng】本中大鼠【shǔ】中间小电导钙【gài】激活钾离子通【tōng】道亚家【jiā】族N成员2(KCNN2)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标本检验，标【biāo】本的【de】正常浓度值均在试剂盒提供的【de】检【jiǎn】测范围【wéi】内，实验过程【chéng】中直接取50μL样本上样即【jí】可。当有部分【fèn】样本值超过标准品浓度【dù】时，可用样【yàng】本稀释液将标本进行适当【dāng】稀释后再进行【háng】实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从【cóng】冰箱中取出的浓缩洗涤【dí】液可能有结晶，属于正常【cháng】现【xiàn】象；放置室温，轻摇均匀，待【dài】结【jié】晶溶解后再配置【zhì】洗【xǐ】涤液。可将20ml浓缩洗【xǐ】涤液用【yòng】蒸馏水或去离子水稀释配【pèi】置成400ml工作浓【nóng】度的洗涤【dí】液，未用完的【de】放回4℃

3. 20×洗涤缓冲液的【de】稀【xī】释：蒸馏水【shuǐ】按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加【jiā】19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预【yù】先包被大鼠中间小电导钙激活钾离子通道亚家族N成员2(KCNN2)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标【biāo】准品【pǐn】、HRP标记的检测【cè】抗体，经过温育洗涤。用底【dǐ】物TMB显色，TMB在过氧化物酶的【de】催化下【xià】转【zhuǎn】化成蓝【lán】色，并在酸的作【zuò】用下转【zhuǎn】化成【chéng】黄【huáng】色。颜色【sè】的深浅和样品【pǐn】中【zhōng】的大鼠中间【jiān】小电导钙【gài】激活钾【jiǎ】离子通道【dào】亚家【jiā】族N成【chéng】员2(KCNN2)呈【chéng】正【zhèng】相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计【jì】算【suàn】样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然【rán】后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上【shàng】清【qīng】即可【kě】，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存【cún】，但应避【bì】免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采【cǎi】集标本，并将标本在采集后【hòu】的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上【shàng】清即可检测，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反【fǎn】复冻融【róng】。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆【jiāng】中【zhōng】裂解的红细胞会影【yǐng】响测量结果），称重【chóng】后将【jiāng】组织剪碎【suì】。将剪【jiǎn】碎的组织与【yǔ】对应体积的PBS（一般按1:9的【de】重量体积比【bǐ】，比如1g的【de】组【zǔ】织样【yàng】品对应9mL的PBS，具体体【tǐ】积可根据实验【yàn】需要适当调整，并做好记录。推荐在【zài】PBS中加入蛋白酶抑制剂【jì】）加入玻璃匀【yún】浆【jiāng】器中，于冰上充【chōng】分研磨。为了进【jìn】一步裂解组织细胞【bāo】，可以对【duì】匀【yún】浆液进行超【chāo】声破【pò】碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上【shàng】清【qīng】检测【cè】。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进【jìn】行检测的可保存于4℃，若不能【néng】及时检测，请按【àn】一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月【yuè】内检【jiǎn】测），或-80℃（6个月内检【jiǎn】测），避免反【fǎn】复【fù】冻融，标本【běn】溶血会影【yǐng】响检测结果，因此溶血【xuè】标【biāo】本不宜进行此项【xiàng】检测。

注意事项：

1. 严格按照规【guī】定【dìng】的时间和【hé】温度进行温育以保证准确结果。所【suǒ】有试剂都必须【xū】在使【shǐ】用前达【dá】到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板【bǎn】不正确可【kě】以导致不准【zhǔn】确的结果。在加入底物前确保尽【jìn】量吸【xī】干孔内液体。温育过【guò】程中不【bú】要【yào】让微孔干【gàn】燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任【rèn】何反应试【shì】剂不能接触漂白溶剂或漂【piāo】白溶【róng】剂所散发的【de】强【qiáng】烈气体。任何漂【piāo】白【bái】成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物【wù】活【huó】性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播【bō】疾【jí】病，所有的样【yàng】品都应【yīng】管【guǎn】理好，按【àn】照规定的【de】程序处理样品和检测装置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝【lǚ】箔袋中【zhōng】取出所【suǒ】需板条，剩余板条用自【zì】封袋密封放【fàng】回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔【kǒng】，标准品【pǐn】孔各【gè】加不同浓度的标【biāo】准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外【wài】，标【biāo】准品孔和样本孔中每【měi】孔加入辣根过氧化【huà】物酶（HRP）标记的检【jiǎn】测抗体100μL，用封板膜封住反应孔【kǒng】，37℃水浴【yù】锅或【huò】恒温箱温育60min。

5．弃【qì】去液【yè】体，吸水纸上拍干，每孔加满洗【xǐ】涤液（350μL），静置【zhì】1min，甩去洗涤液，吸水纸上【shàng】拍【pāi】干【gàn】，如此重复洗板5次（也可用洗板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入【rù】终止【zhǐ】液50μL，15min内，在450nm波长处测定各【gè】孔【kǒng】的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作【zuò】表中【zhōng】，以标【biāo】准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘【huì】制出【chū】标准品线【xiàn】性回归曲【qǔ】线，按【àn】曲线方程计算各【gè】样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉感【gǎn】染，配【pèi】置不同【tóng】浓度标【biāo】准品、上样、加不同试剂都需要更换枪【qiāng】头。另【lìng】外不同试剂【jì】请【qǐng】分【fèn】别使用不同【tóng】的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显色底物在上【shàng】板前应【yīng】为无【wú】色，请避光【guāng】保存；假如【rú】微孔板后，将由【yóu】物【wù】色变成不同深度的蓝色。

5. 终止液上板顺序【xù】应同【tóng】显【xiǎn】色底【dǐ】物上板顺序一致；加入终止液后，孔内颜色由蓝变【biàn】黄；若孔内有【yǒu】绿色，则表【biǎo】明孔内液体未混【hún】匀；请充分【fèn】混合。

说明：

1. 由于现有条件【jiàn】及科学【xué】技术水平【píng】尚【shàng】不能对【duì】所有供货【huò】商提供的所有原【yuán】料【liào】进行全面的鉴定与【yǔ】分析，本产品可【kě】能存在一定的质量技术【shù】风险。

2. 实验结【jié】果【guǒ】与试剂【jì】的有效性、实验者的【de】相【xiàng】关操作以【yǐ】及当时的实验环境密切相关，请务必准备充【chōng】足的标本备份【fèn】。

3. 不同【tóng】批次的同一产品【pǐn】可【kě】能【néng】会有少许【xǔ】差别，如：检测限、灵【líng】敏【mǐn】度【dù】以及显色时【shí】间等，请依据试剂盒内说明书进行【háng】实验操作，网站电子版说明书【shū】仅作【zuò】参考。

4. 只【zhī】有全部【bù】使用本试【shì】剂盒配套【tào】试剂才能保证检测效果【guǒ】，不能混用其他制造商的产品。只【zhī】有严格遵守本试【shì】剂盒的实验说明才【cái】会【huì】得到检【jiǎn】测结果。