单个二倍体细胞

在分析单【dān】精zi以【yǐ】前，Li等人对个体二倍体细胞【bāo】内【nèi】的β珠蛋白基因进行过研究。两 个【gè】组织培养细胞株【zhū】用【yòng】于【yú】这些实验。其中一个【gè】纯合【hé】是镰刀【dāo】型细【xì】胞密【mì】码子6（βS）发生突 变，另一个纯【chún】合子则【zé】来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠【zhū】蛋白片段的 引【yǐn】物，及【jí】能够区【qū】别这两个特异【yì】的等位基【jī】因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯 事细【xì】胞和βB纯合细胞【bāo】和βS纯【chún】合细胞在同一【yī】组织培养瓶中共同培养数天。将用相差【chà】显 微镜观【guān】察到【dào】的混【hún】合培养的单个细胞【bāo】转入溥塑【sù】料胡管内。

分别将【jiāng】单个细【xì】胞转入含裂解液 的PCR管中，保【bǎo】温【wēn】后，加入PCR缓冲液，缓中有【yǒu】四种dDNP．Taq dna聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因【yīn】的PCR引物【wù】。95℃10分【fèn】钟变性靶DNA，然后根【gēn】据【jù】已发表方法的改进【jìn】方案进行 50全循环的扩增【zēng】。通过打点杂交，等量的【de】扩增产物【wù】打点于尼龙膜后，扩增产【chǎn】物【wù】分别与 βA和【hé】βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细【xì】胞只【zhī】与βA和【hé】βS探【tàn】针杂交，杂【zá】交 强弱各【gè】不【bú】相同；19个与βA探针．12个与βS探【tàn】针杂交。

12个以水【shuǐ】作【zuò】空白对照的反应管 中瓜呈阴【yīn】性【xìng】，它表明忽【hū】略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交【jiāo】的【de】样品，它暗【àn】示转 入到反应管中的单个细胞，而【ér】且组织【zhī】培【péi】养基中存在的从βA或βS细胞【bāo】中裂解出来的 DNA并未【wèi】吸【xī】附在【zài】单个细胞上【shàng】。

单【dān】个细【xì】胞的pcr扩【kuò】增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋【dàn】白基【jī】因的【de】质粒 DNA样品在杂交【jiāo】模上的杂【zá】交信号的强度进行【háng】比【bǐ】较确【què】定【dìng】。据估计PCR反应开始时，一个二 倍体细胞【bāo】珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩尔）在5－500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以【yǐ】 平均效率65％计算，经50个循环后它的【de】DNA相【xiàng】当于平【píng】均扩增了7.6×1010倍。考虑【lǜ】到扩 增的程度之大，因【yīn】此排除任何【hé】可能的污染对于单个细【xì】胞的分【fèn】析【xī】十【shí】分关键。

单精zi的分析

我司等人【rén】随后对【duì】位于染色体19编码LDL受【shòu】体【tǐ】(LDLr)的基因的杂合体单精zi的基因型【xíng】 进行【háng】分析。根据已知的DNA序列，他们用PCR和【hé】ASO分析【xī】检测【cè】LDLr的RFLP。PCR的引物【wù】和 探针以前已有报道。单个【gè】精【jīng】zi的分离与二倍体【tǐ】细【xì】胞的分离【lí】方法一样，经蔗糖梯【tī】度 离【lí】心得到纯化【huà】的精zi，精zi于－20℃可【kě】保藏8个月。

显微镜下将单个精【jīng】zi吸入毛细塑 料针管【guǎn】内【nèi】，然后转入试管内【nèi】以作裂解。裂【liè】解的方法与【yǔ】发表的方法冲【chōng】液【yè】(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明胶），0.05mg/ml蛋【dàn】白【bái】酶K，20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保温【wēn】1小时，加入pcr反应【yīng】物以前，样【yàng】品【pǐn】加热到85℃。PCR扩 增。

对80个精ziLDLr基因型已作过分析【xī】。55%的雄配子显示出【chū】杂交信号。22个携【xié】带 LDLr等位基因，21个携带LDLr2基【jī】因。仅一个【gè】与【yǔ】两种探【tàn】针杂交都【dōu】呈【chéng】阳性。16支对照反【fǎn】 应管中加【jiā】入所【suǒ】有反应试剂但【dàn】没有精zi，结果无杂【zá】交信号出现。